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高效液相色谱仪和气相色谱- 质谱联用仪简介
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来源:中国化玻试剂网 添加人:027web 添加时间:2013/12/24 17:02:00

国家质检总局给出的《电子电气产品中多溴联苯(PBB)和多溴联苯醚(PBDE)的测定/高效液相谱法》和《电子电气产品中多溴联

苯(PBB)和多溴联苯醚(PBDE)的测定/气相色谱-质谱法》用的是高效液相色谱仪和气相-质谱(联用)仪,其方法是液相色谱法和

气相色谱-质谱法。应对欧盟RoHS指令,这两种都是全世界测多溴联苯和多溴联苯醚的方法。
(一) 液相色谱法
        早在1903年,俄国植物学家Tswett为了分离植物色素,将植物的石油醚提取液通过装有碳酸钙粉末的玻璃柱,使色素成分得

到了分离,并将这一分离方法命名为色谱法(chromatography)。但在此后的20多年里,几乎无人问津Tswett的液相色谱技术。到了

1931年,Kuhn用液相色谱法成功地分离了胡罗卜素和叶黄素,并因此获得了诺贝尔奖。
液相色谱法(liquid chromatography, 缩写:LC)虽是最早发明的色谱法,但其发展并不是最快的。到了20世纪60年代后期,业已

比较成熟的气相色谱法(gas chromatography, GC)的理论与技术被广泛应用到液相色谱法上来,使液相色谱法得到了迅速发展。填

料制备技术的发展使人们能够得到具有高分离效率的粒径小而均匀的球形颗粒填料,而化学键合型等新型固定相的出现、柱填充技术

的进步以及高压输液泵的不断改进等,使液相色谱分析实现了高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此,这种

分效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)。
液相色谱法与气相色谱法相比,具有以下三方面的优点:
①气相色谱分析采用的流动相是惰性气体,它对组分没有亲和力,即不产生相互作用力,仅起运载作用。而液相色谱法中流动相可选

用不同极性的液体,选择余地大,它对组分可产生一定亲和力。并参与固定相对组分作用的激烈竞争。因此,流动相对分离起很大作

用,相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数,这为选择最佳分离条件提供了极大的方便。
②气相色谱法一般都是在较高温度下进行的,而液相色谱法则经常可在室温下工作。
③气相色谱法分析对像只限于分析气相和沸点较低的化合物,它们仅占有机物总数的20%。对于占有机物总数近80%的那些高沸点、热

稳定性差、摩尔质量大的物质,目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
目前液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质。例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、高聚物、染

料及药物等物质的分离和分析。现在,高效液相色谱法HPLC的应用范围已远远超过气相色谱法GC,位居色谱法之首。HPLC从20世纪60

年代末70年代初发展起来后,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。因此,RoHS的检测HPLC自

然而然成了重要的方法之一。
本文尽可能简单而又不遗漏地介绍HPLC,以便读者选用仪器时对所遇见的各种仪器性能可以比较,最后根据自己需要来选定仪器。
高效液相色谱仪(HPLC)的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化,高速是指在分析上比经典液相色谱法快数百倍。由于经

典色谱是重力加料,流出速度极慢,而HPLC配备了高压输液设备,流速最高可达10cm3/min。例如分离苯的羟基化合物,7个组分只需

1min就可完成。又如对一段氨基酸分离,用经典色谱法,柱长约170cm,柱径0.9cm,流动速度为30m3/min,需要20多小时才能分离出

20中氨基酸;而用
HPLC,只需1h之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb-ODS(5μm)柱,采用梯度洗脱,可在不到0.5h内分离出尿中104个

组分。高效是由于高效色谱应用了颗粒极细、规则均匀的固定相,传质阻力小,分离效率高。因此在经典色谱法中难分离的物质,一

般在HPLC中能得到满意的结果。高灵敏度是由于现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器,使其分析灵敏度比经典色谱有较大的

提高。例如,紫外检测器最小检测限可达10-7g(0.1ppm),而荧光检测器可达10-11g。由于高效液相色谱具有以上的优点,又称作

高速液相色谱或高压液相色谱。
HPLC根据分离机制不同,可分为以下几种类型:液-液分配色谱法、液-固吸附色谱法、离子色谱法、尺寸排阻色谱法与亲和色谱法等

。HPLC分离机理、分类及其主要应用示意如下表:

类别
主要分离机理
主要分析对象或应用领域


吸附色谱
吸附能、氢键
异构体分离、族分离、制备


分配色谱
疏水作用
各种有机化合物的分离、分析与制备


凝胶色谱
溶质分子大小
高分子分离、分子量及分子量分布测定


离子交换色谱
库仑力
无机阴阳离子、环境与食品分析


离子排斥色谱
Donman膜平衡
有机离子、弱电解质


离子对色谱
疏水作用
离子性物质


离子抑制色谱
疏水作用
有机弱酸弱碱


配位体交换离色谱
配合作用
氨基酸、几何异构体


手性色谱
立体效应
手性异构体


亲和色谱
特异亲和力
蛋白、酶、抗体分离、生物和医药分析

 

 

高效液相色谱仪一般可分为四个主要部分:高压输液系统(储掖器、高压泵、脱气器)、进样系统、分离系统和检测系统。此外还配

有辅助装置:如梯度淋洗、自动进样及数据处理等。结构示意图如上图所示其过程如下:
首先高压泵将储液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱,然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时,流经进样器的流动相

将样品同时带入色谱柱进行分离,然后依先后顺序进入检测器,记录仪将检测器送出的信号记录下来,由此得到液相送出的信号记录

下来,由此得到液相色谱图。
1、 高压输液系统
它是高效液相色谱仪最重要的部件,一般由储液器、高压泵、脱气(梯度洗脱)装置组成,其中高压(输液)泵是核心部件。高压泵

用于输送流动相,其压力一般为几兆帕至数十兆帕。高压泵分恒流泵和恒压泵两种,目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械

往复泵。
2、进样系统
一般有如下两类:
(1)隔膜注射进样器 这种进样方式与气相色谱类似。它是在色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜,进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注

入色谱柱。其优点是装置简单、价廉、死体积小,缺点是允许进样量小。
(2)高压进样阀 目前多采用六通阀。其结构和作用原理与气像色谱中所用的六通阀完全相同。由于进样可由定量管的体积严格控制

,由此进样准确,重复性好,适于作定量分析,更换不同体积的定量管,可调整进样量。
3、分离系统—色谱柱
色谱柱是液相色谱仪的心脏部件,它的质量优劣直接影响分离效果。为了减少溶剂用量,一般在分离前有一个前置柱,前置柱内填充

物和分离柱完全一样,这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和,使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相,保证分离

柱的性能不受影响。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料(<20μm)一般采用匀浆填充阀装柱,先将填料调成匀浆,

然后在高压泵作用下,快速将其压入装哟洗脱剂的色谱柱内,经冲洗后,即可备用。
4、检测系统
高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件(高压输液区、色谱仪、检测器)之一,主要用于检测经色谱柱分离后的组分的变化,并

又记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析,一个理想的检测器应具备以下特征:灵敏度高;对所有的溶质都有快速响应;响应对流动

相流量和温度变化都不敏感;不引起柱外谱带扩展;线性范围宽;适用的范围广。但至今还没有一种检测器能够完全具备这些特征。

常用的检测器如下表:

检测器
检测下限
线性范围
选择性
梯度淋洗


紫外光检测器
Ultra violet detector, UVD
10-10
103—104


示差折光检测器
Refractive index detector, RID
10-2
104

不可


荧光检测器
Fluorescence detector, FD
10-12—10-11
103


化学发光检测器
10-13—10-12
103

困难


电导检测器
Electronic conductance detector, ECD
10-8
103—104

不可


电化学检测器
10-10
104

困难


火焰离子化检测器
10-13—10-12
104


在高效液相色谱技术发展中,检测器至今还是一个薄弱环节,它没有相当于气相色谱中使用的导热池检测器和氢火焰离子化检测器那

样的即通用又灵敏的检测器。近几年出现的蒸发激光散射检测器(evaporation laser scattering detector, ELSD)是高效液相色

谱理想的通用检测器。
UVD,RID,ECD,FD四种检测器属于非破坏性检测器,样品流出检测器后可进行馏分收集,并可与其它检测器串联使用;荧光检测器

因测定中加入荧光试剂,对样品产生沾污,当串联使用时应将它放在最后检测。
国家质检总局标准中,HPLC仪用的检测器是紫外可见光检测器。所以,我们只对UVD检测器作些简介,其余不予介绍。
紫外吸收检测器是应用最广泛的一种检测器之一,它是一种选择性检测器,仅适用于对紫外光(或可见光)有吸收的样品的检测。紫

外吸收检测器可分为固定波长型、可调波长型和光电二极管阵列检测器。据统计,在高效液相色谱分析中,约有70%多的样品可以使

用这种检测器。
固定波长紫外吸收检测器由低压汞灯提供固定波长254nm(或280nm)的紫外光。由低压汞灯发出的紫外光经入射石英棱镜准直,经遮

光板分为一对平行光束分别进入流通池的测量臂和参比臂。经流通池吸收后的出射光,经过遮光板、出射石英棱镜及紫外滤光片,只

让254nm(或280nm)的紫外光被双光电池接收。双 光电池检测的光强度经对数放大器转化成吸收光度后,经放大器放大后输至记录

仪。
可调波长紫外吸收检测器才用氘灯作光源,波长在190—600nm范围内可连续调节。光源发出的光经聚光透镜聚焦,由可旋转组合滤光

片滤去杂散光,再通过入口狭缝至至下面反射到达光栅,光栅将光衍射色散成不同波长的单色光,当某一波长的单色光经平面反射镜

,反射至光分束器时,透过光分束器的光通过样品流通池,最终到达的测样品的测量光电二极管;被光分束器反射的光到达检测基线

波动的参比光电二极管;当获得测量和参比光电二极管的信号差,即为样品的检测信息。可变波长紫外吸收检测器的在某一时刻只能

采用某一特定的单色波长的吸收信号。光栅的偏转可由预先编制的采集信号程序加于控制,以便于采集某一特 定波长的吸收信号,

并可使色谱分离过程洗脱出的每个组分峰都获得最灵敏的检测。
光电二极管阵列的紫外吸收检测器,由于采用计算机快速扫描采集数据,可得三维的色谱—光谱图象。所得信息为吸收随保留时间的

波长变化的三维图或轮廓图。从轮廓图可很容易地选择测定各个分析物的最佳波长。
紫外检测器灵敏度较高,通用型也较好,它要求试样必须有紫外吸收,但溶剂必须能透过所选波长的光,选择的波长不能低于溶剂的

最低使用波长。国家质检总局紫外吸收波长指标是226nm。
5、梯度淋洗装置
所谓梯度淋洗,指在分离过程中使流动相的组成随时间该变而改变。通过连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或pH等因素,使

被测组分的相对保留值得以改变,提高分离效率。梯度淋洗对于一些组分复杂及容量因子值范围很宽的样品分离尤为必要。高压液相

中梯度淋洗作用十分类似于气相色谱中的程序升温。两者目的都是为了使样品的组分在最佳容量因子值范围流出柱子,使保留时间过

短而拥挤不堪峰形重叠的组分或保留时间过长而峰形扁平宽大的组分,都能获得良好的分离。它可分为低压梯度和高压梯度两种方式

淋洗。
低压梯度(外梯度)是在常压下将两种溶剂(或多元溶剂)输至混合器中混合,然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中,装置如

下图:
此法的主要优点是仅需要使用一个高压输液泵。如对二元混合溶剂体系,操作时先将弱极性溶剂A通过微处理机控制的低压计量泵和

时间比例电磁阀,直接流入混合器;另一种强极性溶剂B,也通过低压计量泵,并由微处理机控制另一时间比例电磁阀的开关时间,

来调节流入混合器的B溶剂的体积百分数,以控制输出混合溶剂的组成。溶剂A和B在混合器内充分混合后,再用高压输液泵输至色谱

柱。
通过预先设定开启溶剂A、B时间比例电磁阀的运行程序,就可控制二元混合溶剂流动相的组成,并连续出具有不同极性的流动相。此

种梯度洗脱方式可以减少溶剂可压缩性的影响。并能完全消除由溶剂混合引起的热力学体积变化所带来的误差。

 


低压梯度装置示意
1— 低压计量泵;1A、1B—时间比例电磁阀;2—微处理器;3—混合器;4—高压输液泵;5—至色谱柱
目前,大多数高效液相色谱仪皆配有高压梯度(内梯度)装置,它是用两台高压输液泵将强度不同的两种溶剂AB输入混合室,进行混

合后再进入色谱柱。它的主要优点是两台高压泵的流量皆可独立控制,可获得任何形式的梯度程序,且易于实现自动化。国家质检总

局的高效液相色谱仪用的流动相是:甲醇(88.2%)、已二醇(1.8%)、正己烷(10%),洗脱测试PBB或PBDE样品,在合适的梯度淋洗条

件下,将样品个组分在适宜k值下全部流出,即获得良好的测量峰形,又缩短了分析时间。这就是梯度淋洗的优点。
6、工作站
现在的高效液相色谱仪一般都带工作站。所有分析过程都可以在线模拟显示,数据自动采集、处理和存储,并对整个分析实现自动控

制。如果设置好有关分析条件和参数,可以自动给出最终分析结果。
高效液相色谱法的技术还涉及到固定相和流动相,主要类型又分:液固吸附色谱法、液液分配色谱法、化学键合色法、尺寸排阻色谱

法、亲和色谱法、离子色谱法。根据分离不同物质来选类型。限于篇幅关系,就不再介绍。
由于我国多年来一直依赖进口这方面的仪器,暂未见有国产的。
(二)气相色谱—质谱法
1、先谈气相色谱法
气相色谱法是采用气体作为流动相的色谱分析法。此分析方法中,载气是不与被测物相互作用,而是用来载送试样,这些气体有:氢

气、氮气等。载气带着试样通过色谱柱中的固定相,使试样中各组分分开,然后分别进入检测器检测。色谱仪由五大系统组成:气路

系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录系统。其简单流程如下:


(图13-1)
载气由高压钢瓶或气体发生器(目前已有各种制氮气的设备可选)供给,经减压阀减压后,进入载气净化干燥管以除去载气中的水份

。由针形阀控制载气的压力和流量。流量计和压力表用以指示载气的柱前流量和压力。再经过进样器(包括气化室),试样在进样器

注入(液体试样,经气化室瞬间气化为气体)。由不断流入的载气携带试样进入色谱柱,色谱柱装在可调控的柱箱里。经色谱柱,得

到分离的各组分依次进入检测器后放空。组分在检测器中,化学信号被转换成电信号传给记录器。记录器将各组分的浓度变化记录下

来,得到色谱图。
分离系统中,色谱柱是色谱仪的心脏,关系到色谱分离的成败,一般有填充柱和毛细管柱两种。填充柱里装固定相,可以是活性碳、

石墨化碳黑、硅胶、氧化铝、分子筛、GDX(高分子多孔微球),根据分离气体不同而不同。气体从进入到出来,有个效率,用柱子

高度为分母除以效率,所得出的数据叫“理论版/米”,石油化工上提炼汽、煤、柴,更是讲究“理论板/米”,数据越高(与塔里放

的填充物的形状、尺寸有关),分离的越好,塔的高度也就可降低,能源也更节约。色谱柱的高低和柱里的材料决定了其理论板的数

据。一般气相色谱的理论板数是2000,而液相色谱仪可达到5万以上,因此,称为高效液相色谱仪。色谱柱的尺寸大小与需测的内容

有关,不能只考虑效率,还要考虑它的寿命长短,这也是购买仪器时考核的指标。
2、再谈质谱法(mass spectrometry, MS)的原理。
将样品分子置于高真空中(<10-3Pa),并受到高速电子流或强电场等作用,失去外层电子而生成分子离子,或化学键断裂生成各种

碎片离子,然后将分子离子和碎片离子引入一个强的正电场中,使之加速,加速电位通常用6—8KV,此时所有带电单位正电荷的离子

获得的动能都一样。不同质荷比的离子具有不同的速度,利用离子不同质荷比以及其速度差异,质量分析趋可将其分离。然后由检测

器测量其强度。记录后获得一张以质荷比(m/z)为横坐标,以相对强度为纵坐标的质谱图。
分析的基本过程可以分为四个环节:①通过合适的进样装置将样品引入并进行气化;②气化后的样品引入到离子源进行电离,即离子

化过程;③电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器,按不同的质荷比进行分离;④经过检测、记录,获得一张谱图。根据质

谱图提供的信息,可以进行无机物和有机物定性与定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中同位素比的测定以及固体表面的结构和

组成的分析等。这四个中,核心是实现样品离子化。
质谱仪按其用途可分:同位素质谱仪、无机质谱仪、有机质谱仪等。根据质量分析器的工作原理,分动态仪器和静态仪器两大类型。

典型的质谱仪一般由进样系统、离子源、质量分析器、检测器和记录系统等部分组成,此外,还包括真空系统和自动控制数据处理等

辅助设备。
以下为单聚焦质谱仪示意图:

 


3、气相色谱-质谱法是用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)。气相色谱仪是质谱法的理想“

进样器”,试样经色谱仪分离后以纯物质形式进入质谱仪,就可以充分发挥质谱仪的特长;质谱仪是气相色谱仪的理想“检测器”,

色谱法所用的检测器如氢焰电离检测器、热导池检测器、电子捕获检测器等都有局限性,而质谱仪能检出几乎全部化合物,灵敏度又

很高。所以色谱-质谱联用技术既发挥了色谱法的高分离能力,又发挥了质谱法的高鉴别能力。

GC-MS工作原理
当一个混合样品用微量注射器注入气相色谱仪的进样器后,样品在进样器中被加热气化。由载体载着样品气通过色谱柱,色谱柱内填

有某种固定相,不同分析对象应选不同固定相。色谱柱可分为两类,一类是填充柱,另一类是毛细管柱。由于气相色谱仪独特的分离

能力,在一定的操作条件下(柱温、载体流量和柱前压等),每种组分离开色谱柱出口的时间不同。从进样时算起来至某个组分的区

域中心离开色谱柱出口的时间是这个组分的保留时间。
如果有某种器件装在色谱柱出口,能使到达柱出口的某组分转化为电信好。这个信号经放大器放大后可在记录仪上得到色谱峰的图形

。上述器件在色谱仪中称为检测器,如热导池、氢火焰和电子俘获检测器等。在GC-MS中不使用这些检测器,而是用离子源中的一个

总离子检测极(TIC)代替它。在色谱仪出口,载气已完成它的历史使命,需设法筛去,保留组分的分子进入质谱仪的离子源中。分

子分离器的作用就是尽可能地把载气筛去,只让组分的分子通过。因为这时组分的量甚微,进入质谱仪时,不至会严重破坏质谱仪的

真空。

样品的中性分子进入质谱仪的离子源后,被电离为带电离子,还会有一部分载气进入离子源(GC-MS操作中常用氦气作载气)。这部

分载气和质谱仪内残余气体分子一起被电离为离子并构成本底。样品离子和本底离子一起被离子加速电压加速,射向质谱仪的分析器

中,在进入分析器前,设计好的总离子检测极(TIC),收集总离子流的一部分。总离子检测极收集的离子流经放大器放大并记录下

来,在记录纸上得到的图形实际上就是该组分的色谱峰。总离子色谱峰由底到峰顶再下降的过程,就是某组分出现在离子源的过程。

目前,绝大多数质谱仪都与数据系统连接,得到的质谱信号可通过计算机接口,输入计算机。在进行GC-MS操作时,从进样起,质谱

仪开始在预的质谱范围内,磁场作自动循环扫描,每次扫描给出一组质谱,存入计算机,计算机算出每组质谱的全部峰强总和,作为

再现色谱峰的纵坐标。每次扫描的起始时间t1,t2,t3,….作为横坐标。这样每一次扫描给出一个点,这些点连线给出一个再现的

色谱峰。它和总离子色谱峰相似。数据系统可给出每个再现色谱峰峰顶所对应的时间---保留时间。
再现的色谱峰可以计算峰面积进行定量分析。
利用再现的色谱峰,可任意调出色谱上任何一点所对应的一组质谱。色谱峰顶处可获得无畸变的质谱。 仪器分类有多种方法,按机

械尺寸可粗略分为大型、中型、小型;按性能为高档、中档、低档或研究级和常规级两类/GC-MS通常指气相色谱-四极杆质谱或磁质

谱,GC-ITMS通常是指气相色谱-离子阱质谱,GC-TOFMS是指气相色谱-飞行时间质谱等。国家质检总局和国内外大多厂家都推GC-MS。

但要注意各种仪器的分辨率,有高(一般高于5000)、中(1000—5000)和低(1000以下)。一般GC-MS是2000。
设备中的气相色谱需要的气体有三种:氮气、氢气和氦气,一般用氦气,其余都不合适。这种气体一般是高压钢瓶充填,要严格管理

(包括排气不能排到室内)。
GC-MS已广泛用于环保部门对有害物质的低含量、痕量检测,食品添加剂等的检测,法庭科学的各种检测,体育界中的兴奋剂检测等

等。应对欧盟RoHS中,用来检测多溴联苯和多溴联苯醚不但是我质检总局指引,也是世界各国使用的仪器。遗憾的是暂还未见有国产

 

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