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蛋白多肽分离纯化
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来源:中国化玻试剂网 添加人:027web 添加时间:2013/12/23 17:29:00

操作方法:
A  将含有氨基酸的样品溶液与衍生反应液混合,室温反应1小时,得到氨基酸PITC衍生物溶液
B  用正己烷液液萃取除去干扰物
C  按迪马科技提供的液相色谱条件使用Diamonsil AAA色谱柱分析 
迪马科技氨基酸分析套装的优势:
A 广泛适用于食品、生物样品、药品等各种基质中的氨基酸分析
B Diamonsil AAA PITC氨基酸专用柱具有超高柱效
C 能够分离的氨基酸种类多达21种
D 采用迪马科技推荐的条件分析天然氨基酸时,各组分间的分离度超过2.0

 

                                                                                                       18种天然氨基

酸的液相色谱图

1 Asp(天冬氨酸) 2 Glu(谷氨酸) 3 Ser(丝氨酸) 4 Gly(甘氨酸) 5 His(组氨酸) 
6 Arg(精氨酸) 7 Thr(苏氨酸) 8 Ala(丙氨酸) 9 Pro(脯氨酸) 10 NH3(氨) 
11 Tyr(酪氨酸) 12 Val(缬氨酸) 13 Met(蛋氨酸) 14 Cys-Cys(胱氨酸) 15 Ile(异亮氨酸) 
16 Leu(亮氨酸) 17 Nle(正亮氨酸) 18 Phe(苯丙氨酸) 19 Trp(色氨酸) 20 Lys(赖氨酸)

     
药物代谢分析主要涉及血液(血清、血浆)、尿液等基质中药物及其代谢的检测,尽管样品呈液态,但由于基质含有大量蛋白质、以及

少量脂肪,因而不适合直接仪器分析。对于这种分析项目,迪马科技推荐的解决方案是:SPE(固相萃取)-HPLC或LC-MS分析。在前处

理方面,迪马科技推荐使用聚合物基质的固相萃取柱——ProElut PLS、PXC、PXA、PWC、PWA。在仪器分析方面,迪马科技推荐

Diamonsil 2、Spursil、Platisil等系列反相HPLC色谱柱。Diamonsil 2系列色谱柱在药物分析方面具有普遍适用性,而Spursil、

Platisil系列色谱柱对强极性药物具有较好的保留和分离,三者结合能够满足绝大多数药物代谢分析应用。

ProElut 聚合物基质固相萃取柱介绍

名称 吸附剂 作用基团 保留机理 应用 
ProElut PLS
亲水亲脂平衡柱 含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯
 苯乙烯基
吡咯烷酮基
 亲水亲脂平衡 中性、弱酸性、弱碱性药物
及其代谢物 
ProElut PXC
混合型强阳离子交换反相柱 含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯
上键合磺酸基团 磺酸基团
苯乙烯基
吡咯烷酮基 强阳离子交换
反相 碱性药物及其代谢物 
ProElut PXA
混合型强阴离子交换反相柱 含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯
上键合季铵基团
 季铵基团
苯乙烯基
吡咯烷酮基 强阴离子交换
反相 酸性药物及其代谢物 
 ProElut PWC
混合型弱阳离子交换反相柱 含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯
上键合羧基 羧基
苯乙烯基
吡咯烷酮基 弱阳离子交换
反相 带有季铵基团的药物
及其代谢物 
ProElut PWA
混合型弱阴离子交换反相柱 含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯
键合哌嗪基团 哌嗪基团
苯乙烯基
吡咯烷酮基 阴离子交换
反相 带有磺酸、磷酸等基团的药物
及其代谢物

 ProElut 聚合物基质固相萃取柱的通用操作方法

A ProElut PLS的通用操作方法(以ProElut PLS,60 mg/3 mL为例)

操作 目的 
活化/平衡:
3 mL甲醇活化,3 mL水平衡; 活化:用甲醇除去吸附剂中的干扰物,并使吸附剂上的疏水基团展开;
平衡:用水洗去活化过程进入吸附剂的甲醇,为上样创造合适的溶剂环境; 
上样:
加入3 mL样品溶液; 样品溶液通常为纯水溶液或含少量甲醇的水溶液,此时溶剂体系的极性较强,弱
酸性、弱碱性以及中性有机化合物会通过反相机制被吸附剂上的疏水基团保留; 
淋洗:
3 mL 5%甲醇水溶液淋洗; 除去蛋白质、无机盐以及其他水溶性干扰物; 
洗脱:
3 mL纯甲醇洗脱,收集洗脱液; 极性较弱的甲醇能够破坏目标化合物与吸附剂疏水基团间的非极性相互作用(亦
即反相作用力),将目标化合物洗脱下来; 
溶液重组:
蒸干并用合适的溶剂重新溶解;
 使样品浓缩,并调整溶剂以方便仪器分析。

 

ProElut PXC的通用操作方法(以ProElut PXC,60 mg/3 mL为例)

操作 目的 
活化/平衡:
3 mL甲醇活化,3 mL水平衡; 活化:用甲醇除去吸附剂中的干扰物,并使吸附剂上的基团展开;
平衡:用水洗去活化过程进入吸附剂的甲醇,为上样创造合适的溶剂环境; 
上    样:
加入3 mL酸化样品溶液; 吸附剂上的磺酸基团因解离性较强始终呈阴离子状态,而在低pH值下,碱性化合
物(主要为胺基化合物)结合质子呈阳离子状态,两者间存在库仑力从而保留住碱
性化合物;中性化合物通过反相机制被保留;酸性化合物的离子化被抑制,通过
反相机制被保留; 
淋洗一:
3 mL 0.1 mol/L HCl淋洗; 增强阳离子态的碱性化合物与磺酸基团间的库伦力;除去蛋白质和盐 
 淋洗二:
3 mL 纯甲醇溶液淋洗; 纯甲醇能打断非极性相互作用(亦即反相作用力),除去通过反相机制保留的干扰
物,并洗脱未解离的酸性化合物和中性化合物; 
洗脱:
3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱; 氨水能中和碱性化合物结合的质子,使碱性化合物变为中性,打断了碱性化合物
与磺酸基团间的库仑力,而甲醇则破坏了碱性化合物与吸附剂上疏水基团间的非
极性相互作用,碱性化合物被洗脱; 
溶液重组:
蒸干并用合适的溶剂重新溶解。 使样品浓缩,并调整溶剂以方便仪器分析。

 

ProElut PXA的通用操作方法(以ProElut PXA,60 mg/3 mL为例)

操作 目的 
活化/平衡:
3 mL甲醇活化,3 mL水平衡; 活化:用甲醇除去吸附剂中的干扰物,并使吸附剂上的基团展开;
平衡:用水洗去活化过程进入吸附剂的甲醇,为上样创造合适的溶剂环境; 
上样:
加入3 mL中性或碱性样品溶液; 吸附剂上的季铵基团因解离性较强始终呈阳离子态,而中性或碱性条件下,酸性
化合物解离成阴离子,两者间存在库仑力从而使酸性化合物被保留;中性化合物
和碱性化合物通过反相机制被保留; 
淋洗一:
3 mL 5%氨水溶液淋洗; 增强酸性化合物阴离子与季铵基团间的库仑力,使酸性化合物被稳定保留;除去
蛋白质和盐; 
淋洗二:
3 mL纯甲醇淋洗; 纯甲醇能打断非极性相互作用(亦即反相作用力),除去反相机制保留的干扰物,并
洗脱中性和未解离的碱性化合物; 
洗脱:
3 mL 2%甲酸甲醇溶液; 甲酸给出质子,使阴离子态的酸性化合物结合质子呈中性,库伦力被打断,而甲醇
则破坏了反相作用力,酸性化合物被洗脱; 
溶液重组:
蒸干并用合适的溶剂重新溶解。 使样品浓缩,并调整溶剂以方便仪器分析。

 

ProElut PWC的通用操作方法(以ProElut PWC,60 mg/3 mL为例)

操作 目的 
活化/平衡:
3 mL甲醇活化,3 mL 5%氨水溶液平衡; 活化:用甲醇除去吸附剂中的干扰物,并使吸附剂上的基团展开;
平衡:用水洗去活化过程进入吸附剂的甲醇,氨水则能结合吸附剂上羧基给出的质
子,使离子交换位点(羧基)呈阴离子态,为保留强阳离子目标化合物创造合适的溶
剂环境; 
上样:
加入3 mL中性或碱性样品溶液; 强碱性目标化合物在水溶液中始终以阳离子形式存在,与吸附剂上的离子交换位点
(阴离子化的羧基)间存在库仑力,因而被保留;中性化合物通过反相机制被保留;
普通碱性化合物的离子化被抑制,通过反相机制被保留; 
淋洗一:
3 mL 5%氨水溶液淋洗; 增强强碱性化合物阳离子与羧基阴离子间的库伦力,使强碱性化合物被稳定保留;
除去蛋白质和盐; 
淋洗二:
3 mL纯甲醇淋洗; 纯甲醇能打断非极性相互作用(亦即反相作用力),除去离子化的酸性化合物、中性
化合物以及弱碱性化合物; 
洗脱:
3 mL 2%甲酸甲醇溶液; 甲酸给出质子,使吸附剂上阴离子态的羧基结合质子呈中性,强碱性化合物与吸附
剂间的库伦力被打断,而甲醇则破坏了反相作用力,强碱性化合物被洗脱; 
溶液重组:
蒸干并用合适的溶剂重新溶解; 使样品浓缩,并调整溶剂以方便仪器分析。


ProElut PWA的通用操作方法(以ProElut PWA,60 mg/3 mL为例)

操作 目的 
活化/平衡:
3 mL甲醇活化,3 mL 2%甲酸水溶液平衡; 活化:用甲醇除去吸附剂中的干扰物,并使吸附剂上的基团展开;
平衡:用水洗去活化过程进入吸附剂的甲醇,甲酸则向吸附剂上的己二胺基提供质
子,使离子交换位点呈阳离子态,为保留强阴离子目标化合物创造合适的溶剂环境; 
上样:
加入3 mL样品溶液; 强酸性化合物在水溶液中始终以阴离子形式存在,与吸附剂上的阴离子交换位(亦即
阳离子化的己二胺基)点间存在库仑力,因而被保留;中性化合物通过反相机制保留;
酸性化合物的离子化被抑制,通过反相机制被保留; 
淋洗一:
3 mL 2%甲酸水溶液淋洗; 增强强酸性化合物阴离子与己二胺基阳离子间的库伦力,使强酸性化合物被稳定保留;
除去蛋白质和盐; 
淋洗二:
3 mL 纯甲醇溶液淋洗; 纯甲醇能打断非极性相互作用(亦即反相作用力),除去通过反相机制保留的干扰物,并
洗脱解离的碱性化合物、中性化合物以及未解离的酸性化合物; 
洗脱:
3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱; 氨水能够中和吸附剂上己二胺基结合的质子,使离子交换位点变为中性,打断了强酸性
化合物与离子交换位点间的库仑力,而甲醇则破坏了反相作用力,强酸性化合物被洗脱; 
溶液重组:
蒸干并用合适的溶剂重新溶解。 使样品浓缩,并调整溶剂以方便仪器分析。

 


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