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乳制品中L-羟脯氨酸的测定
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来源:中国化玻试剂网 添加人:027web 添加时间:2013/12/23 17:16:00

 皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉,将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定,主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特有的氨基酸,在乳酷蛋白中则没有,所以一旦检出,则可认为含有皮革水解蛋白,即为“皮革奶”。本实验提供两种L-羟脯氨酸衍生方法,利用氨基酸分析柱,对L-羟脯氨酸进行分析检测,可根据实际情况进行选择。
 

2 仪器与试剂
 

2.1 仪器、器皿
2.1.1 HPLC+紫外检测器
2.1.2 Diamonsil AAA氨基酸分析柱(CAT#: 99751) 。
2.1.3 11 mL水解瓶(CAT#: 55354)
2.1.4 1.5 mL塑料离心管。
2.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管。
2.1.7 0.22 μm针式过滤器(CAT#:37177)。
2.1.8 2 mL样品瓶(瓶:CAT#:5323,盖CAT#:5325)
 

2.2 试剂
2.2.1 甲醇(CAT#:50102)。
2.2.2 乙腈(CAT#:50101)
2.2.3 正己烷(CAT#:50115)
2.2.3 三乙胺(CAT#:50131)
2.2.4 冰醋酸(CAT#:50132)
2.2.5 三乙胺(CAT#:50131)
2.2.6 磷酸氢二钠(CAT#:50158)
2.2.7 磷酸二氢钠(CAT#:50157)
2.2.8 L-羟脯氨酸(CAT#:46587)
2.2.9 蛋白水解试剂:称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶,加入50 mL浓盐酸(36%-38%,摩尔浓度约为12 mol/L),然后加水定容至100 mL。
2.2.10 0.1 mol/L HCl水溶液:量取8.3 mL浓盐酸,然后用纯水定容至1000 mL。
2.2.11 衍生剂PITC溶液:将250 μL异硫氰酸苯酯(PITC)用乙腈定容至10 mL。
2.2.12 三乙胺溶液:将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。
2.2.13 衍生剂DNFB溶液:0.5 mL 2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶于50 mL乙腈。
2.2.14 Na2B4O7缓冲溶液:称取1.91 g Na2B4O7·10 H2O,用50 mL纯水溶解。
2.2.15 氨基酸储备液:称取一定量L-羟脯氨酸,用0.1 mol/L HCl水溶液溶解,得到浓度为  0.05 mol/L的储备溶液。
2.2.16 氨基酸使用液:将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释,得到浓度为0.0003 mol/L的L-羟脯氨酸溶液。
2.2.17 磷酸盐缓冲溶液:0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。
 

3 实验方法
 

3.1 样品水解
称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中(2.1.3),加入蛋白水解试剂(2.2.9),旋紧盖子,振荡混匀,110 °C下反应24 h。
反应完毕,将反应液全部转移至100 mL蒸馏瓶中,75℃下减压蒸馏至近干。
用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液(2.2.10)分三次溶解残渣,并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管(2.1.5),再用纯水定容至20 mL,待衍生。
 

3.2 样品衍生
3.2.1 异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法
(1)样品水解溶液衍生
 量取200 μL样品水解溶液,置于1.5 mL塑料离心管中,加入100 μL三乙胺溶液(2.2.12)和100 μL衍生剂PITC溶液(2.2.11),混匀,室温反应1h,加入400μL正己烷(2.2.3),旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合,经0.22 μm针式过滤器(2.1.7)过滤,待分析。
(2) 标准溶液衍生化
 量取200 μL L-羟脯氨酸使用液*(2.2.16),置于1.5 mL塑料离心管中,加入100 μL三乙胺溶液(2.2.12)和100 μL衍生剂PITC溶液(2.2.11),混匀,室温反应1h,加入正己烷400 μL(2.2.3),旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合,经0.22 μm针式过滤器(2.1.7)过滤,待分析。
*根据实际情况,氨基酸使用液浓度可进行调整,本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。
3.2.2 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生方法
(1) 样品溶液衍生
取0.5 mL样品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度试管(2.1.6)中,加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液(2.2.14)和0.5 mL衍生剂DNFB溶液(2.2.13),具塞摇匀,于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却,用磷酸盐缓冲溶液(2.2.17)定容至5 mL,混匀后经0.22 μm针式过滤器(2.1.7)过滤,待分析。
(2) 标准溶液衍生
取0.5 mL L-羟脯氨酸使用液(2.2.16)置于5 mL玻璃具塞刻度试管(2.1.6)中,加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液(2.2.14)和0.5 mL衍生剂DNFB溶液(2.2.13),具塞摇匀,于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却,用磷酸盐缓冲溶液(2.2.17)定容至5 mL,混匀后经0.22 μm针式过滤器(2.1.7)过滤,待分析。
 

3.3 色谱条件
3.3.1 异硫氰酸苯酯(PITC)衍生色谱条件

色谱柱 Diamonsil AAA 250×4.6 mm,5 μm(Cat.#:99751)
流动相A  0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)
流动相B  甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)
流速 1.0mL/min
检测波长  UV 254 nm
柱温 45 ℃
进样体积 10 μL

 

梯度程序

时间/min 0 39 40 45 46 60
流动相A/% 95 52 0 0 95 95
流动相B/%  5 48 100 100 5 5


3.3.2 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生色谱条件

 

色谱柱 Diamonsil AAA 250×4.6 mm,5 μm(Cat.#:99751)
流动相A  0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液
流动相B 甲醇 : 乙腈=10 : 90 (V : V)
流速 1.0mL/min
检测波长  UV 360 nm
柱温 35℃
进样体积 10 μL


梯度程序
 

时间/min 0 39 44 44.01 65
流动相A/% 86 60 30 86 86
流动相B/%  14 40 70 14 14

 

4 色谱图

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